Ingeniería de la proteína BLS para la construcción de dispositivos nanofotónicos y mediciones estructurales basadas en nanoscopía de fluorescencia
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Date
18 de septiembre de 2024
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Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Abstract
La fabricación de nanoestructuras a partir de moléculas biológicas es un campo de investigación muy activo. En 2006 se desarrolló un método revolucionario, llamado “Origamis de ADN”, para formar estructuras nanométricas a base de DNA. Diversos trabajos demostraron que estas estructuras podían funcionar como sistemas de andamiaje donde organizar nanopartículas, fluoróforos y proteínas, y las aplicaciones de los origamis de ADN se expanden día a día. Las proteínas pueden aportar una herramienta alternativa y complementaria al campo de la nano- fabricación. En comparación con el ADN, las proteínas tienen la ventaja de poseer mayor rigidez estructural, gran diversidad de funciones químicas y biológicas, y la capacidad de auto-ensamblarse en estructuras de mayor tamaño y complejidad. En este contexto, esta tesis explora la ingeniería de una proteína específica para el diseño de dispositivos nanofotónicos, es decir, estructuras fabricadas en base a proteínas que sirvan para manipular luz e interacciones luz-materia en escala nanométrica. La proteína modelo se llama Lumazina Sintasa de Brucella (o BLS por sus siglas en inglés). La misma es un homo-decámero, ensamblado como dímero de pentámeros. Algunas ventajas de emplearla como bloque de construcción son su alta termoestabilidad y su resistencia frente a desnaturalizantes químicos. Así mismo, sus extremos N-terminales se encuentran libres y disponibles para la fusión con otros polipéptidos así como cualquier otro tipo de moléculas. En primer lugar, aprovechando que el decámero de BLS forma una cavidad que podría albergar pequeñas moléculas, se incorporaron en ella fluoróforos y se caracterizaron sus propiedades ópticas en este entorno. Luego, combinando de manera novedosa dos metodologías de microscopía de molécula única, se caracterizó la movilidad y la orientación relativa de dichos fluoróforos respecto a la proteína. Con este método fue posible determinar que los fluoróforos se ubican en la cavidad en dos orientaciones preferenciales. Es destacable que esta información estructural se obtuvo en un microscopio óptico, a temperatura ambiente, y en entorno líquido, y de hecho se observaron transiciones dinámicas de los fluoróforos entre las dos orientaciones preferenciales. Estos experimentos constituyen avances en dos frentes. Por un lado, los resultados obtenidos demuestran que la nana fabricación por ingeniería de proteínas es una estrategia prometedora y ampliamente aplicable para estudiar las interacciones entre moléculas pequeñas y proteínas, así como una herramienta atractiva para controlar la orientación de los fluoróforos empleando un andamio biológico, allanando el camino para aplicaciones en bionanofotónica que dependen de la orientación molecular. Por otro lado, la metodología desarrollada representa un paso importante en la tendencia actual de obtener información estructural de biomoléculas en condiciones biológicamente relevantes, en incluso de observar dinámicas. En este sentido, en otro capítulo de esta tesis, expandimos este concepto modificando a BLS para aplicar nanoscopías de fluorescencia con resolución nanométrica, y así medir, en condiciones biológicamente relevantes, las dimensiones de la proteína. Otra investigación de BLS como plataforma para dispositivos nanofotónicos fue el ensamblado de sistemas multicromofóricos. Usando la multiplicidad de funcionalidades que ofrece BLS, se incorporaron grupos funcionales de especificidad en un extremo de un pentámero, y fluoróforos en el otro extremo. Este constructo multicromofórico fue evaluado como marcador para microscopía de super-resolución por ubicación de moléculas individuales, con el objetivo de obtener un marcador más eficiente que los tradicionales. Si bien se logró marcar y visualizar actina con BLS por super-resolución, no se hallaron grandes mejorías respecto a otros marcadores existentes o desarrollados en simultáneo con esta tesis. Finalmente, con el objetivo de ensamblar nano-antenas ópticas basadas en BLS, se estudió el ensamblado de nanopartículas de oro sobre los extremos de BLS. Se lograron obtener oligómeros de nanopartículas de oro mediante dos estrategias diferentes que involucran a BLS. Estudios de partícula única revelaron que dichas poblaciones son heterogéneas. Este enfoque requiere de más investigación para obtener protocolos que permitan fabricar nanoantenas con control estequiométrico de proteínas y nanopartículas.