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Recent Submissions
tesis de prueba
(2024-09-22) Bongiovanni, Lucia
Ingeniería de la proteína BLS para la construcción de dispositivos nanofotónicos y mediciones estructurales basadas en nanoscopía de fluorescencia
(Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 18 de septiembre de 2024) Sosa, Santiago; Goldbaum, Fernando Alberto; Levi, Valeria
La fabricación de nanoestructuras a partir de moléculas biológicas es un campo de investigación muy activo. En 2006 se desarrolló un método revolucionario, llamado “Origamis de ADN”, para formar estructuras nanométricas a base de DNA. Diversos trabajos demostraron que estas estructuras podían funcionar como sistemas de andamiaje donde organizar nanopartículas, fluoróforos y proteínas, y las aplicaciones de los origamis de ADN se expanden día a día. Las proteínas pueden aportar una herramienta alternativa y complementaria al campo de la nano- fabricación. En comparación con el ADN, las proteínas tienen la ventaja de poseer mayor rigidez estructural, gran diversidad de funciones químicas y biológicas, y la capacidad de auto-ensamblarse en estructuras de mayor tamaño y complejidad. En este contexto, esta tesis explora la ingeniería de una proteína específica para el diseño de dispositivos nanofotónicos, es decir, estructuras fabricadas en base a proteínas que sirvan para manipular luz e interacciones luz-materia en escala nanométrica. La proteína modelo se llama Lumazina Sintasa de Brucella (o BLS por sus siglas en inglés). La misma es un homo-decámero, ensamblado como dímero de pentámeros. Algunas ventajas de emplearla como bloque de construcción son su alta termoestabilidad y su resistencia frente a desnaturalizantes químicos. Así mismo, sus extremos N-terminales se encuentran libres y disponibles para la fusión con otros polipéptidos así como cualquier otro tipo de moléculas. En primer lugar, aprovechando que el decámero de BLS forma una cavidad que podría albergar pequeñas moléculas, se incorporaron en ella fluoróforos y se caracterizaron sus propiedades ópticas en este entorno. Luego, combinando de manera novedosa dos metodologías de microscopía de molécula única, se caracterizó la movilidad y la orientación relativa de dichos fluoróforos respecto a la proteína. Con este método fue posible determinar que los fluoróforos se ubican en la cavidad en dos orientaciones preferenciales. Es destacable que esta información estructural se obtuvo en un microscopio óptico, a temperatura ambiente, y en entorno líquido, y de hecho se observaron transiciones dinámicas de los fluoróforos entre las dos orientaciones preferenciales. Estos experimentos constituyen avances en dos frentes. Por un lado, los resultados obtenidos demuestran que la nana fabricación por ingeniería de proteínas es una estrategia prometedora y ampliamente aplicable para estudiar las interacciones entre moléculas pequeñas y proteínas, así como una herramienta atractiva para controlar la orientación de los fluoróforos empleando un andamio biológico, allanando el camino para aplicaciones en bionanofotónica que dependen de la orientación molecular. Por otro lado, la metodología desarrollada representa un paso importante en la tendencia actual de obtener información estructural de biomoléculas en condiciones biológicamente relevantes, en incluso de observar dinámicas. En este sentido, en otro capítulo de esta tesis, expandimos este concepto modificando a BLS para aplicar nanoscopías de fluorescencia con resolución nanométrica, y así medir, en condiciones biológicamente relevantes, las dimensiones de la proteína. Otra investigación de BLS como plataforma para dispositivos nanofotónicos fue el ensamblado de sistemas multicromofóricos. Usando la multiplicidad de funcionalidades que ofrece BLS, se incorporaron grupos funcionales de especificidad en un extremo de un pentámero, y fluoróforos en el otro extremo. Este constructo multicromofórico fue evaluado como marcador para microscopía de super-resolución por ubicación de moléculas individuales, con el objetivo de obtener un marcador más eficiente que los tradicionales. Si bien se logró marcar y visualizar actina con BLS por super-resolución, no se hallaron grandes mejorías respecto a otros marcadores existentes o desarrollados en simultáneo con esta tesis. Finalmente, con el objetivo de ensamblar nano-antenas ópticas basadas en BLS, se estudió el ensamblado de nanopartículas de oro sobre los extremos de BLS. Se lograron obtener oligómeros de nanopartículas de oro mediante dos estrategias diferentes que involucran a BLS. Estudios de partícula única revelaron que dichas poblaciones son heterogéneas. Este enfoque requiere de más investigación para obtener protocolos que permitan fabricar nanoantenas con control estequiométrico de proteínas y nanopartículas.
Abundancia y distribución del picofitoplancton marino (Prochlorococcus, Synechococcus y picofitoplancton eucariota) a escala global y su relación con el ciclo del carbono
(Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024) Visintini Adomaitis, Natalia Soledad; Flombaum, Pedro; Saraceno, Martín
El fitoplancton cumple un rol fundamental en el ciclo del carbono, convirtiendo CO2 a carbono orgánico en la superficie del océano. El fitoplancton de mayor tamaño celular contribuye al hundimiento del carbono orgánico particulado (POC) en la columna de agua. Sin embargo, aún no está clara la contribución del picofitoplancton, el grupo de menor tamaño celular, al hundimiento de POC en el océano profundo. Si bien el picofitoplancton domina el bioma más extenso del planeta, el océano oligotrófico, los modelos biogeoquímicos no siempre lo incluyen en sus componentes, lo que puede contribuir a aumentar la incertidumbre. Se sostiene que el grupo no contribuye al hundimiento de POC porque es remineralizado velozmente en aguas superficiales por su baja densidad y pequeño tamaño. Sin embargo, nueva evidencia desafía esta idea. Los principales aportes de la tesis son, primero, concentrar información sobre las principales componentes del picofitoplancton (Prochlorococcus, Synechococcus y picofitoplancton eucariota) para cruzar bases de datos con distintas líneas de evidencia. Segundo, definir regiones en base a la abundancia y permanencia del picofitoplancton en el año. Finalmente, identificar las regiones en las que es posible detectar el aporte del picofitoplancton a la exportación de POC. En su conjunto, la tesis aporta una mirada nueva a una pregunta de interés global como es el aporte del picofitoplancton al hundimiento de carbono.
Agua superficial de las llanuras del núcleo agroproductivo de Argentina : análisis basado en múltiples líneas de evidencia
(Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024) Cappelletti, Lucía María; Sörensson, Anna A.; Penalba, Olga Clorinda
Esta tesis tiene como objetivo avanzar en la descripción y entendimiento de la dinámica del agua superficial y sub-superficial de llanuras agrícolas propensas a inundarse con nivel freático poco profundo, como consecuencia del cambio de uso de suelo de vegetación perenne -nativa o cultivada- a cultivos anuales. La región que aquí se estudia es el sudeste de la provincia de Córdoba, Argentina. Adicionalmente, a lo largo de esta tesis se analiza y se expone la coherencia hidrológica de productos que se basan en diferentes paradigmas, con el fin de mostrar la importancia del uso de múltiples líneas de evidencia. En primer lugar, se desarrolló, se calibró y se puso a prueba una herramienta para la detección de agua superficial de llanuras agrícolas en la que el nivel freático se encuentra próximo a la superficie. Esto permitió poner en evidencia que inundaciones y anegamientos de la región, identificadas por productos globales como categoría “agua abierta” no están constituidas simplemente por agua, sino que también están dadas por combinaciones de agua con suelo desnudo y vegetación. Para la implementación de esta herramienta se empleó información espectral de satélites del tipo óptico. Se exploró también si el cambio de extremos diarios y mensuales de precipitación, que suele ser empleado como indicador del cambio de inundaciones, es apto para la caracterización del tipo de inundaciones que sufre la región de interés. Para este análisis se utilizaron datos in situ y productos satelitales. El mismo reveló que las inundaciones de la región han aumentado sin presentar cambios en el régimen de sus precipitaciones. Además, si se compara el presente (las últimas dos décadas) con el pasado (las dos décadas anteriores al presente), la asociación entre el nivel freático y las inundaciones se ha vuelto más fuerte, y las inundaciones más reactivas a la precipitación acumulada. En ninguno de los dos periodos hay asociación entre las inundaciones y los extremos de precipitación considerados, no obstante si la hay si se considera precipitación acumulada. De este estudio se ha derivado que el uso aislado de cambios en índices de extremos diarios y mensuales de precipitación, generalmente utilizados por la comunidad climatológica internacional para estudiar cambios en inundaciones, no son un proxy adecuado del comportamiento de las inundaciones en llanuras agrícolas estancadas, donde la acumulación de excesos graduales de precipitación y el estado freático son relevantes. Por otro lado, se exploró la humedad del suelo superficial como variable que integra la interacción entre reservorios, mecanismos de entrada y salida de agua del suelo de la región. Esto se realizó utilizando estimaciones satelitales y mediciones in situ como fuentes de información complementarias entre sí. En este contexto, y siendo que la red de dispositivos empleada fue instalada con el fin de evaluar estimaciones de misiones satelitales, se espera que la dinámica de los cultivos y de las inundaciones se exprese en la dinámica de la humedad del suelo a escala temporal anual y diaria en ambas fuentes de información. Sin embargo, se encontró que los dispositivos in situ utilizados fueron instalados cerca de viviendas en lugar de campos de cultivo propensos a inundarse, que es la cobertura dominante de la región. En este sentido, se evaluó el sesgo introducido por la ubicación de los dispositivos in situ en una cobertura de suelo que no es representativa de la región, mostrando que estos no captan la diferencia entre las temporadas de cultivo inactivo y activo en cuanto a la disponibilidad diaria de agua del suelo. Además, no captan el fenómeno de anegamiento como si lo hacen las misiones satelitales. También se expone el impacto de las lagunas de datos en los registros de humedad del suelo superficial de misiones satelitales con pocos años de datos disponibles al calcular estadísticas representativas, y la importancia de que los sistemas satelitales incorporen en sus rangos de humedad del suelo la respuesta de regiones propensas a inundarse. Finalmente, se evaluó el desempeño del modelo de superficie ORCHIDEE en representar procesos hidrológicos de llanuras agrícolas con napa freática poco profunda y la transformación de su dinámica sobre la región de estudio, como resultado del cambio de uso y cobertura del suelo. Al integrar un modelo de superficie en esta tesis, no sólo se incorpora una fuente más de información, sino también un procedimiento de análisis de los procesos involucrados en los anegamientos e inundaciones de un sistema que posee consistencia física entre las variables que lo fuerzan y las que simula. Los resultados sugieren que, aunque ORCHIDEE puede capturar ciertos aspectos de los procesos hidrológicos en las llanuras agrícolas de Argentina, aún existen desafíos para modelar con precisión el cambio hidrológico observado. Es importante resaltar que los aspectos sí capturados fueron resultado de ajustar los parámetros del uso y cobertura de suelo a los de la región de estudio, en lugar de utilizar la información default del modelo de ORCHIDEE, cuyos parámetros que describen los ciclos de cultivo se corresponden a datos de observación procedentes principalmente de latitudes altas del hemisferio norte. En este capítulo, se expone la complejidad del desajuste entre los resultados del modelo y el cambio hidrológico observado, que posiblemente confunde la performance del modelo, con la incertidumbre intrínseca de los forzantes, y la adecuación de los parámetros sobre el uso y cobertura de suelo, para la representación de la región de estudio de esta tesis. A lo largo de este trabajo se resalta la importancia de emplear múltiples líneas de evidencia, sobre todo en regiones donde los datos son escasos, como es el caso de la que aquí se estudia. Para ello, no solo se combinó el uso de mediciones in situ, estimaciones satelitales y salidas de modelo de superficie terrestre, sino también informes locales de instituciones nacionales y subnacionales como otra pieza de conocimiento de valor fundamental.
Nanopartículas multifuncionales para suministro controlado de enzimas
(Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 08 de noviembre de 2024) Montero Oleas, Andrea Cristina; Aldabe Bilmes, Sara Alfonsina; Marceca, Ernesto José
Los nanomateriales ofrecen un gran potencial para dirigir moléculas hacia lugares específicos dentro de fluidos. Se han explorado diversos tipos de nanoobjetos, como liposomas, polímeros y nanopartículas, como nanovehículos (NVs). Entre ellos, los NVs inorgánicos son especialmente ventajosos debido a su bajo costo, buena biocompatibilidad y la capacidad de modificar su superficie para una liberación dirigida. Dentro de un nanovehículo, una molécula está protegida de la degradación y puede liberarse en el sitio deseado mediante estímulos externos como químicos, magnetismo, luz o ultrasonido. La luz es especialmente prometedora por ser no invasiva y permitir el control remoto. Las nanopartículas de sílice mesoporosa (mSiO2) destacan por su tamaño ajustable, su estructura porosa y la posibilidad de funcionalizar la superficie, lo que las hace ideales para aplicaciones en nanomedicina. Las nanopartículas de oro (AuNPs) aportan propiedades únicas a los sistemas basados en mSiO2 gracias a sus bandas de resonancia plasmónica superficial localizada. Esto permite una conversión eficiente de luz en calor mediante el efecto fototérmico. Esta combinación de alta capacidad de carga y propiedades fototérmicas se utiliza en las partículas core-shell Au@mSiO2. Para diseñar estas partículas, es crucial considerar factores como el diámetro de las partículas, el tamaño y la funcionalización de los poros, y la forma del core de oro para optimizar la eficiencia fototérmica y la liberación dirigida. Esta tesis presenta una nueva síntesis de partículas de Au@mSiO2 con poros grandes, con el objetivo de encapsular proteínas de manera efectiva para aplicaciones en terapia proteica. Se exploró el mecanismo de síntesis mediante un método one-pot, logrando un diseño reproducible de partículas Au@mSiO2 con un control preciso del tamaño. Para obtener partículas con poros grandes, se utilizaron métodos de síntesis por crecimiento de semillas, donde se creció una capa de sílice con poros más grandes sobre una semilla pre-sintetizada. Se investigaron dos estrategias para crear estas estructuras: (1) usar agentes expansores de poros para producir capas de sílice con poros de hasta 7 nm de diámetro, y (2) emplear crecimiento estratificado en un medio bifásico, donde grandes hemimicelas actuaron como plantillas para crear poros de hasta 20 nm de diámetro. La estabilidad de las partículas sintetizadas se evaluó en condiciones que simulan ambientes fisiológicos (100 mM PBS) para determinar su fiabilidad en aplicaciones biomédicas. La estabilidad de las nanopartículas dependió del método de síntesis y de la concentración de partículas. El método de crecimiento bifásico resultó en nanopartículas más estables, que mantuvieron su forma durante hasta 3 días en un medio de alta salinidad, incluso a concentraciones por debajo del límite de solubilidad de la sílice. Se demostraron las capacidades de retención y protección de proteínas de las nanopartículas sintetizadas utilizando tres proteínas modelo: albúmina de suero bovino, peroxidasa de rábano y proteína fluorescente roja, cada una con estructuras y pesos moleculares diferentes. Los resultados mostraron que la capacidad de absorción de proteínas estaba directamente relacionada con el tamaño de los poros y la estructura de las proteínas. Además, las proteínas encapsuladas en nanopartículas de poro grande demostraron una mayor estabilidad en comparación con las proteínas libres en solución, indicando que las paredes de los poros protegen eficazmente las proteínas de factores de estrés ambientales. En conclusión, esta tesis presenta un método de síntesis optimizado que combina métodos one-pot y crecimiento bifásico para producir nanopartículas con tamaños de poro ajustables (de 3 a 20 nm), diámetros finales controlados (~100 nm), alta estabilidad en condiciones cercanas a las fisiológicas, y que son óptimas para retener proteínas. Estas nanopartículas de Au@mSiO2 con poros grandes representan un avance significativo en el campo de la nanomedicina, ofreciendo una plataforma prometedora para la liberación controlada de proteínas.